Joshua F. Emory(1) ; Jeff Dahl(1) ; Vikki Johnson(1) ; Brian J. Feild(1) ; Harsha Gunawardena(2)
(1)Shimadzu Scientific Instruments, Columbia, MD, United States

(2)Janssen Research and Development, The Janssen Pharmaceutical Companies of Johnson & Johnson, Spring House, PA, United States

 

Teljesen automatizált online fehérjeemésztés, affinitás alapú leválasztás, intakt tömegelemzés, gyógyszerek és a gazdasejt fehérjék peptid feltérképezése egyetlen elemzésben.

Bevezetés

A fehérje alapú gyógyszerek hatóanyagának és szennyezéseinek vizsgálata LCMS módszerrel általában offline emésztést és tisztítást igényel. Az automatizált fehérjeemésztő-rendszerek a reprodukálhatóság növelése, a laborhatékonyság növelése és nem utolsó sorban a mintával történő emberi interakció csökkentése végett jöttek létre. Bár a peptidek feltérképezése és az Immuno-MS munkafolyamatok jól megalapozottak az online emésztés szempontjából, bonyolultabb, ortogonális elemzéseket még nem kellett feltárni. A célfehérjék emésztése elvégezhető affinitás alapú elválasztással (depletion) vagy anélkül is úgy, hogy a szennyező fehérjék visszanyerését növeljük A konfiguráció megfelelő kialakítása lehetővé teszi a fehérjék szétválasztásának és intakt tömegadatainak megszerzését az ugyanazon mintából származó peptidadatok mellett, két párhuzamos áramlási útvonal alkalmazásával.

Módszerek

Human IgG (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO)

293 HEK Cell Lysate (Janssen R&D, Spring House, PA)

Mobile Phases A/B: 0.1% Formic in Water, 0.1% Formic in Acetonitrile, (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO)

RP Column (peptide separation): 2.1x50mm C18 Aeris peptide Widepore (Phenomenex, CA)

RP Column (protein separation): Restek Ultra C4 column (5µm 150x2.1mm)

Affinity capture column: Protein A column (Perfinity BioSciences, West Lafayette, IN)

Gradient: 2% to 35% Acetonitrile at 0.15 mL/min over 90 minutes for QTOF experiments

MS system: Shimadzu 9030 QTOF (Shimadzu, Kyoto, Japan)

LC system: Perfinity Workstation (Shimadzu, Kyoto, Japan and Perfinity BioSciences, West Lafayette, IN)

Proprietary Perfinity Buffers for Digestion, Affinity Loading, Affinity Elution enable online protein digestion, affinity capture and depletion for analysis of human IGG and HEK 293 cell lysate mixtures.

Digestion conditions were four minutes at 50 degrees centigrade.

Eredmények és Konklúzió

Sejtlizátum fehérjék azonosítása

Kísérleti megfigyelések

Hígítatlan sejtlizátum emésztése 20 ug teljes fehérje koncentrációban, a hígított sejtlizátum négyszeres hígítás vagy 5 ug összes fehérje volt.

Az emberi IgG kinyerése egy-egy 10 µg humán IgG- és HEK293-sejt-lizátum fehérjét tartalmazó mintából.

Fehérje A/G oszlop használata az emberi IgG kinyerésére, amely lehetővé tette a nem kötött sejtlizát fehérjék emésztését.

Az IgG affinitás-megkötése a hulladékba juttatott sejtlizátum-fehérjével azt mutatja, hogy az IgG vagy annak megfelelő mAb szelektíven eltávolítható a gazdasejt fehérje szennyeződéseiből.

Akár IgG emészés vagy intakt LCMS tömegelemzés is elvégezhető az online affinitás alapú elválasztást követően.

Az IgG affinitás-megkötési kísérletben megfigyelt alacsony sejtlizátum-fehérje szintje lehet „hitch hiker” fehérje vagy eltávolítatlan fehérje.

További módszermódosításokra lehet szükség a meg nem kötött fehérjék emésztésének fokozásához.

A NIST mAb 1 mg/ml oldatának intakt tömegelemzését Nexera LC (nem Perfinity) rendszerrel, LCMS-9030 QTOF alkalmazásával készült.

Eredmények: IgG intakt tömegelemzése

Összefoglalás

A Perfinity Workstation és a  Shimadzu QTOF készülékek segítségével egy modell gazdasejt emésztését és LCMS elemzését lehetett elvégezni. Két HEK293 sejtlizátum minta emésztését követően sok fehérje azonosítása vált lehetségessé.

Ezen túlmenően a HEK293 sejtlizátum és IgG keverékéből az IgG affinitás-megkötését vagy csökkentését a Perfinity Workstation-nel hajtották végre, amely lehetővé tette az online sejtemésztést és a sejtlizátum fehérjék vagy az IgG elemzését.

Az IgG affinitás alapú leválasztás hatékonyan eltávolította az IgG-t a mintából, lehetővé téve a meg nem kötött sejtlizátum fehérjék emésztését és elemzését.

Az IgG affinitás megkötése eltávolította a sejtlizátum fehérjék nagy részét, így az emésztett peptidek túlnyomórészt az IgG-ből származnak.

A NIST mAb intakt tömegelemzése az LCMS-9030 használatával demonstrálja az intakt tömeg és a peptid leképezési adatok gyűjtésének lehetőségét ugyanabból a mintából.

Jövőbeli fejlesztési lehetőségek

További fehérjeemésztési eljárások és affinitás alapú tisztítások/elválasztások kidolgozása a gyógyászatban releváns készítmények esetében.

Ha tetszett, oszd meg:

Regisztráció

Miért érdemes regisztrálnia?

  • hozzáférhet védett tartalmakhoz, applikációkhoz
  • feliratkozhat szakmai hírleveleinkre, melyekben értesítjük az Ön szakterületét érintő friss hírekről
  • igénybe veheti online support szolgáltatásunkat

addRegisztrálok

Friss tartalom

A bomlásból származó hisztamin és tiramin, a hisztidin és a tirozin degradációjából keletkezik mikroorganizmusok hatására. Ha a lefogyasztott élelmiszerek, előre feldolgozott termékek, vörös húsú halak mint tonhal, bonito, makréla stb., nagy mennyiségű hisztamint tartalmaznak, akkor ételmérgezési tünetek jelentkezhetnek úgy mint láz, kiütések, szívdobogás. Az erjesztett élelmiszerekhez -mint bor vagy sajt- szintén kapcsolódhat hasonló jelenség. Ezenkívül a tiramin is erősítheti a hisztamin toxicitását, és az élelmiszerrel összefüggő migrén okozójaként jelentették.

Bár Japánban nincsenek speciális hisztaminnal kapcsolatos előírások, más országokban, beleértve az Egyesült Államokat és az EU-t, a hal- és halászati termékekre vonatkozóan a Codex (Nemzetközi Élelmiszer Szabványok) szabályozási határértékeit állapították meg. Mivel a tiramin és a hisztamin -az aminosavakhoz hasonlóan- aminocsoportot tartalmaz, a fluoreszcencia detektálása lehetséges az orto-ftal-aldehiddel (OPA) való derivatizálással. Itt bemutatunk egy példát a tiramin és a hisztamin elemzésére a Prominence Amino Acid Analysis rendszer segítségével, amelyben a detektálást oszlop utáni fluoreszcens származékképzéssel végezzük. Az ehhez az alkalmazáshoz rendelkezésre álló mozgófázis és reagens készlet tartalmazza a szükséges mozgófázisokat és reagenseket, így kiküszöbölik a mozgófázis előkészítésétéből adódó bizonytalanságot. Ezen kívül, mivel a minta előkezelése csak szűrést és hígítást tartalmaz ennél az alkalmazásnál, így az elemzés bonyolult feldolgozás nélkül is elvégezhető.

2021. szeptember 1-től a Simkon Kft. látja el a Biotage teljes körű képviseletét Magyarországon.

A tandem tömegspektrométer és a Probe Electrospray Ionization (PESI) módszer kombinációja lehetővé teszi Everolimus és Abirateron komponensek kvantitatív vizsgálatát plazmából, közvetlenül a fehérjekicsapást követően.

A megfelelő rendszerindítási folyamat: a HPLC rendszer ekvilibrálása és a specifikus rendszeralkalmassági teszt (SST) futtatása kritikus lépések az LC futtatások előtt azért, hogy biztosítsuk a magas adatminőséget (reprodukálhatóság, pontosság, stb.) és hogy csökkentsük a karbantartás költségeit, növeljük az oszlop élettartamát. Ezek a lépések időigényesek a felhasználó számára, de ha nem megfelelően végzi ezeket el, az adatromláshoz és a szükséges újramérés miatti időveszteséghez vezetnek. Ebben az összefoglalóban azt mutatjuk be, hogy a Shimadzu hogyan tudja automatikusan felkészíteni a készüléket a mérésre.

A sejttenyésztési folyamatok optimalizálása és ellenőrzése elengedhetetlen a biofarmakonok termelési hatékonyságának növeléséhez. A sejtterápia területén -beleértve a regeneratív gyógyászati eljárásokat is- különösen fontossá vált a tenyésztési folyamatok fokozott ellenőrzése, csökkentve ezzel a sejtek variabilitását és javítva a sejtek tömegtermelésének konzisztenciáját. Ezen célokra hasznos információt ad a kutatóknak a sejttenyészet felülúszó összetevőinek monitorozása. Jelenleg a tenyésztési folyamat felügyeletét pH méréssel, oldódó gázok és néhány komponens, pl.: glükóz, glutamin, laktát és ammónia mennyiségének mérésével végzik.

A műszerek leállása gyakran költséges és időigényes, de legtöbbször a problémák gyorsan megoldhatóak némi hibaelhárítási ismerettel.

 

Az LC és GC kromatográfiás hibaelhárítási útmutató célja, hogy segítse a kromatográfusokat a gyakori LC vagy GC problémák felmérésében. A füzet tartalmazza, hogyan lehet hatékonyan elhárítani és kijavítani ezeket a problémákat, hogy lehetővé tegye a rendszer újraindítását és az elemzések folytatását.

A hagyományos metanizálóval ellentétben nem kell a rendszert átalakítani és plusz gáz bevezetése sem szükséges ahhoz, hogy CO-t és CO2-t tudjunk mérni FID detektorral, széles koncentrációtartományban. A metanizálás az átalakított FID fúvókában történik meg, a fúvóka cseréje és használata is egyszerű. Beszerelhető Shimadzu GC-2030 készülékek FID detektorába. Ajánljuk mindenkinek, aki CO-t és CO2-t is mérni szeretne gázmintákból FID detektorral a rendszer átalakítása nélkül.

Teljesen automatizált online fehérjeemésztés, affinitás alapú leválasztás, intakt tömegelemzés, gyógyszerek és a gazdasejt fehérjék peptid feltérképezése egyetlen elemzésben.

Váltson hidrogénre, megéri.

A gázkromatográfiás méréseknél számos vivőgázt lehet használni: hélium, hidrogén, nitrogén, argon. A rendszer teljesítményjellemzőit és az adott módszer lehetőségeit a vivőgáz jelentősen tudja befolyásolni, ezért nem mindegy, hogy milyen vivőgázt választunk a gázkromatográfunkhoz. Jelenleg a legtöbb esetben héliumra esik a választás, mert inert és jó elválasztást lehet vele elérni. Egyes alkalmazásokhoz előszeretettel nitrogént választanak (töltetes oszlopos alkalmazások), másokhoz hidrogént. Az argon használata nem jellemző. Célszerű ezért áttekinteni azt, hogy az analitikusoknak milyen lehetőségeik vannak a vivőgázt illetően, melyik milyen tulajdonságokkal bír, és hogy miért, milyen analitikai/gazdasági megfontolásból válasszuk egyiket vagy a másikat.

Az utóbbi években a hélium ára jelentősen emelkedett, ami előrevetítette azt, hogy alternatív vivőgázokra is nyitottak legyünk. Sőt, a rendszerünket függetleníthetjük a palackoktól, ha gázgenerátor szolgáltatja a vivőgázt.

A környezetanalitika egyik alappillére a vízanalitika. A természeti erőforrások -például a folyók, az óceánok és a talaj- végesek, és mindannyian kötelesek vagyunk megőrizni azokat a jövő generációinak számára. A világban, amelyben ma élünk, továbbra is jelentős terhelésnek tesszük ki ezeket az erőforrásokat olyan gyakorlatok révén, mint az ipari gyártás. Alapvető fontosságú tehát, hogy az újrahasznosítás, az erőforrások újrafeldolgozása és a szennyezés csökkentése révén megőrizzük és megvédjük környezetünket. Ezeket csak pontos monitorozással és elegendő mennyiségű méréssel lehet megvalósítani. A Shimadzu ICPMS-2030 egyszerű, robusztus és pontos eszköz a minták mérésére, hogy az újrafeldolgozási folyamatok és a gyártási folyamatok megfelelően és felelősségteljesen irányíthatóak legyenek.