Bevezetés

A sejttenyésztési folyamatok optimalizálása és ellenőrzése elengedhetetlen a biofarmakonok termelési hatékonyságának növeléséhez. A sejtterápia területén -beleértve a regeneratív gyógyászati eljárásokat is- különösen fontossá vált a tenyésztési folyamatok fokozott ellenőrzése, csökkentve ezzel a sejtek variabilitását és javítva a sejtek tömegtermelésének konzisztenciáját. Ezen célokra hasznos információt ad a kutatóknak a sejttenyészet felülúszó összetevőinek monitorozása. Jelenleg a tenyésztési folyamat felügyeletét pH méréssel, oldódó gázok és néhány komponens, pl.: glükóz, glutamin, laktát és ammónia mennyiségének mérésével végzik.

Kifejlesztettünk egy „Sejttenyésztő tápoldat elemző platformot, C2MAP rendszert”, amely egyesíti a tenyészet felülúszó mintáinak automatikus minta-előkészítő modulját és az LC/MS/MS technikát. Ez a rendszer az automatikus minta-előkészítést követően akár 95 vegyület egyidejű elemzését is el tudja végezni, beleértve a bazális közeg komponenseit és a szekrétum metabolitokat. (A célvegyületek listáját az 1. táblázat mutatja.) A rendszer tartalmaz egy szoftvert is, amely a képes megjeleníteni a tenyészet felülúszó összetevőinek időbeli változását.

Sejttenyésztő tápoldat elemző platform, C2MAP

A sejttenyésztő tápoldat elemző platform (C2MAP) minta-előkészítő modulból (C2MAP2000), UHPLC rendszerből (Nexera X2) és LCMS-8060/-8050 hármas kvadrupol tömegspektrométerből áll. (1. ábra).

Miután a sejteket eltávolítottuk a tenyésztőfolyadékból, a felülúszót (400-500 ml) tartalmazó ampullákat a C2MAP-2000 mintatartóba helyezzük (max. 65 minta). A minta-előkészítés és a mérés folyamatát a 2. ábra mutatja be.

 

A készülék speciális szoftvere képes vezérelni mind a minta-előkészítő modult, mind az LC/MS/MS rendszert, ami lehetővé teszi a zökkenőmentes analízist, az előkészített minták és a hozzájuk tartozó mérési eredmények könnyű összekapcsolását, mivel az előkészítés és a mérés ugyanazzal az mintaazonosítóval történik.

 A szoftver segítségével az előkészítés és a mérés folyamata is könnyen nyomon követhető. (3. ábra)

Az LC/MS/MS adatokara támaszkodva a C2MAP TRENDS szoftver segítségével grafikusan megjeleníthető az egyes összetevők mennyiségének időbeli változása. Az analitikus figyelemmel kísérheti a bazális közeg összetevőinek és a szekrétum metabolitjainak változását a tenyésztés során, valamint grafikonok segítségével össze tud hasonlítani különböző tenyésztési sorozatokat. Ezek a megfigyelések hasznos információt nyújthatnak az optimális tenyésztési feltételek és a tenyésztési folyamat kiválasztásában.

Eredmények és diszkusszió

A pluripotens őssejtek (PSC) jellemző tulajdonsága, hogy a differenciálatlan állapotot fenntartják. Kísérletünkben a C2MAP rendszert használtuk a tenyészet felülúszó összetevőinek időbeli változását vizsgálva differenciálatlan humán iPS sejtekben és differenciált megfelelőiben. A kísérlet eredményeképpen azt tapasztaltuk, hogy egyes komponensek mennyiségének időbeli változásában szignifikáns különbség volt. (5. ábra). Úgy gondoljuk, hogy ezek a vegyületek lehetséges markerei lehetnek a tenyésztési folyamatnak.

A magzati szarvasmarha szérum (FBS) gyakran befolyásolja a sejtek növekedését. Az alábbi kísérletben a felülúszóban található komponensek ingadozását vizsgáltuk különböző FBS tételek esetén. Három különböző tételt elemeztünk C2MAP rendszerrel, 56 vegyületet tudtunk kimutatni az FBS mintákból. Megállapítható, hogy az egyes tételek MS kromatogram mintázata hasonló volt, viszont néhány vegyület mennyiségében jelentős különbségeket észleltünk (6. ábra).

Következtetés

A C2MAP rendszer segítségével a sejttenyészet felülúszó komponenseinek monitorozásával számos hasznos információhoz juthatunk, mely információk segítséget nyújtanak a táptalaj összetétel és a tenyésztési folyamatok optimalizálásában.

Ha tetszett, oszd meg:

Regisztráció

Miért érdemes regisztrálnia?

  • hozzáférhet védett tartalmakhoz, applikációkhoz
  • feliratkozhat szakmai hírleveleinkre, melyekben értesítjük az Ön szakterületét érintő friss hírekről
  • igénybe veheti online support szolgáltatásunkat

addRegisztrálok

Friss tartalom

Az 1. rész leírja a mintaüvegek adszorpciójának mechanizmusait, és azt, hogyan csökkenthető ez az adszorpció kereskedelmi forgalomba hozott, alacsony adszorpciós fiolák (LabTotal Vial és TORASTTM-H Bio Vial) használatával. Az utóbbi időben számos kérés érkezett alacsony adszorpciós polipropilén (PP) pipettahegy (PP tip) kifejlesztésére. Ezek a kérések olyan felhasználóktól érkeznek, akik szabványos PP hegyeket használnak mintavételre, hígításra és minta-előkészítésre, és azt tapasztalták, hogy az adszorpció rontja az analitikai eredmények megbízhatóságát.

Ennek megfelelően, a TORAST-H Bio Vial fejlesztését folytatva, a Shimadzu a PP hegyekhez való adszorpciót is vizsgálta, és megkezdte egy alacsony adszorpciós PP hegy kifejlesztését, és a világon először forgalomba hozta a TORAST-H pipettahegyet. Ebben a részben bemutatjuk a PP hegyek adszorpciójának jelenségét, áttekintést adunk a TORAST-H Tipről, és ismertetjük annak adszorpciót csökkentő hatását.

Összefoglalónkkal szeretnénk rávilágítani a komponensek vialban történő adszorpciójának problémájára, lehetséges megoldására.

Az automata mintaadagolóval injektált minta kapilláris csöveken keresztül jut el a(z) (U)HPLC oszlophoz. Ha a mintaoldószer és a mozgófázis nem megfelelően keveredik amíg a minta eléri az oszlopot, a csúcs alakja torzulhat. A csúcs kiszélesedik, ha a mozgófázisnál nagyobb elúciós erősségű mintaoldószert használunk. Ez hatványozottan jelentkezik a kisebb belső átmérőjű csöveket alkalmazó UHPLC-rendszerek esetén.

A folyadék-folyadék extrakció (LLE), támogatott folyadék extrakció (SLE), és szilárd fázisú extrakció (SPE) technikák már évtizedek óta léteznek, és ha szerves minta-előkészítést végez, akkor legalább az egyik technikában már járatos. De ismeri-e mindegyik technikát? Miben hasonlóak? Miben különbözőek? Tekintse át ezt velünk!

A Shimadzu LC/MS/MS foszfolipid MRM-könyvtár két módszert tartalmaz: egyet a foszfolipidek osztályozására a biológiai minták fő foszfolipideinek átfogó elemzéséhez, a másikat pedig a zsírsavösszetétel meghatározására, amelyet az osztályozási módszerrel kapott analitikai eredmények felhasználásával hoztak létre. A könyvtár a 14-22 szénatomszámú zsírsavakat tartalmazó foszfolipideket célozza meg, és több mint 867 komponenshez tartalmaz MRM-átmeneteket. A könyvtár lehetővé teszi a foszfolipid profilalkotás elvégzését egy foszfolipid osztályozási módszerrel végzett kezdeti elemzéssel. Ezt követi egy módszer létrehozása a zsírsavösszetétel meghatározására az első analízis során kimutatott foszfolipidcsúcs alapján, majd ezt használva egy második elemzés elvégzése során a zsírsavösszetétel meghatározása történik meg.

A bomlásból származó hisztamin és tiramin, a hisztidin és a tirozin degradációjából keletkezik mikroorganizmusok hatására. Ha a lefogyasztott élelmiszerek, előre feldolgozott termékek, vörös húsú halak mint tonhal, bonito, makréla stb., nagy mennyiségű hisztamint tartalmaznak, akkor ételmérgezési tünetek jelentkezhetnek úgy mint láz, kiütések, szívdobogás. Az erjesztett élelmiszerekhez -mint bor vagy sajt- szintén kapcsolódhat hasonló jelenség. Ezenkívül a tiramin is erősítheti a hisztamin toxicitását, és az élelmiszerrel összefüggő migrén okozójaként jelentették.

Bár Japánban nincsenek speciális hisztaminnal kapcsolatos előírások, más országokban, beleértve az Egyesült Államokat és az EU-t, a hal- és halászati termékekre vonatkozóan a Codex (Nemzetközi Élelmiszer Szabványok) szabályozási határértékeit állapították meg. Mivel a tiramin és a hisztamin -az aminosavakhoz hasonlóan- aminocsoportot tartalmaz, a fluoreszcencia detektálása lehetséges az orto-ftal-aldehiddel (OPA) való derivatizálással. Itt bemutatunk egy példát a tiramin és a hisztamin elemzésére a Prominence Amino Acid Analysis rendszer segítségével, amelyben a detektálást oszlop utáni fluoreszcens származékképzéssel végezzük. Az ehhez az alkalmazáshoz rendelkezésre álló mozgófázis és reagens készlet tartalmazza a szükséges mozgófázisokat és reagenseket, így kiküszöbölik a mozgófázis előkészítésétéből adódó bizonytalanságot. Ezen kívül, mivel a minta előkezelése csak szűrést és hígítást tartalmaz ennél az alkalmazásnál, így az elemzés bonyolult feldolgozás nélkül is elvégezhető.

2021. szeptember 1-től a Simkon Kft. látja el a Biotage teljes körű képviseletét Magyarországon.

A tandem tömegspektrométer és a Probe Electrospray Ionization (PESI) módszer kombinációja lehetővé teszi Everolimus és Abirateron komponensek kvantitatív vizsgálatát plazmából, közvetlenül a fehérjekicsapást követően.

A megfelelő rendszerindítási folyamat: a HPLC rendszer ekvilibrálása és a specifikus rendszeralkalmassági teszt (SST) futtatása kritikus lépések az LC futtatások előtt azért, hogy biztosítsuk a magas adatminőséget (reprodukálhatóság, pontosság, stb.) és hogy csökkentsük a karbantartás költségeit, növeljük az oszlop élettartamát. Ezek a lépések időigényesek a felhasználó számára, de ha nem megfelelően végzi ezeket el, az adatromláshoz és a szükséges újramérés miatti időveszteséghez vezetnek. Ebben az összefoglalóban azt mutatjuk be, hogy a Shimadzu hogyan tudja automatikusan felkészíteni a készüléket a mérésre.

A sejttenyésztési folyamatok optimalizálása és ellenőrzése elengedhetetlen a biofarmakonok termelési hatékonyságának növeléséhez. A sejtterápia területén -beleértve a regeneratív gyógyászati eljárásokat is- különösen fontossá vált a tenyésztési folyamatok fokozott ellenőrzése, csökkentve ezzel a sejtek variabilitását és javítva a sejtek tömegtermelésének konzisztenciáját. Ezen célokra hasznos információt ad a kutatóknak a sejttenyészet felülúszó összetevőinek monitorozása. Jelenleg a tenyésztési folyamat felügyeletét pH méréssel, oldódó gázok és néhány komponens, pl.: glükóz, glutamin, laktát és ammónia mennyiségének mérésével végzik.