Naoki Asakawa írása

Technical Advisor, Analytical & Measuring Instruments Division, Shimadzu Corporation

Az LC/MS rendszerek fejlesztésében és elválasztási technológiájában elképesztő előrelépések történtek az elmúlt években, valamint az LC/MS egyre szélesebb körben elterjedt használata vonzó analitikai eszköz lett különféle alkalmazásokhoz, beleértve a létfontosságú jelenségek felderítését, a betegségek diagnosztizálását, a gyógyszerfejlesztést, valamint az élelmiszerrel és a környezettel kapcsolatos területeken. Ezen alkalmazások közül rendkívül szelektív és rendkívül érzékeny detektálási teljesítménye miatt az LC/MS elengedhetetlen analitikai eszköz a nyomnyi mennyiségű mintakomponensek mennyiségi meghatározásához.

Az LC/MS használatával új probléma is felmerül. Mivel az LC/MS nagy érzékenységgel képes detektálni, az LC/MS-sel mért minták koncentrációja nagyon alacsony is lehet. Ilyen alacsony koncentrációban a minta adszorpciója a mintásüvegben, a mintával érintkező eszközökben és a műszerekben döntő tényező lehet a kvantitatív eredmények megbízhatóságának csökkentésében. Az analitikai kémiával foglalkozók célja az, hogy "miként biztosítható a rendkívül megbízható analitikai eredmények egyszerű és gyors elérése", de vajon sok analitikus mérlegeli-e a mintásüvegben történő adszorpció kérdését?

Az nyilvánvaló, hogy az LC/MS a jövőben fontos szerepet fog játszani mint rendkívül érzékeny kvantitatív mérési lehetőség. Következésképpen az LC/MS segítségével végzett, rendkívül érzékeny kvantitatív elemzések megbízhatóságának növelése rendkívül fontos. Jelen összefoglaló középpontjában a minták üveghez való adszorpciója áll, amely problémát sok analitikus gyakran alulértékel vagy figyelmen kívül hagy. Azt reméljük, hogy ezzel hozzájárulhatunk az LC/MS-sel végzett mennyiségi elemzések javításához.

Az adszorpció frusztráló jelensége és problémája nagyon régre nyúlik vissza. Már 35 évvel ezelőtt HPLC-t használtak a körülbelül 20 aminosavból álló peptidkészítmények elemzésére. A korabeli HPLC-rendszerek távol álltak a ma elérhető automatizált és kifinomult HPLC-rendszerektől, mikrofecskendővel (csiszolt belső felülettel) rögzített mintamennyiséget (több mg/ml) injektáltak, amelyet manuális injektorral juttattak a rendszerbe. Az eredmények közötti eltérés akkoriban jelentős volt, függetlenül attól, hogy hányszor ismételték meg az elemzést, és az ilyen eredmények riasztóak voltak. A változékonyság okának vizsgálata során a kísérleti szakaszban lehetett azt megfigyelni, hogy minél alaposabban öblítették ki a mikrofecskendőt, és minél hosszabb ideig tartózkodott a minta a fecskendőben, annál alacsonyabbak voltak a detektált csúcsok.

Végül rájöttem, hogy a változékonyságot a mintának a mikrofecskendőhöz való adszorpciója okozza. Felismerve azt, hogy a puszta adszorpció milyen nagy hatással van eredményeim megbízhatóságára, erősen szükségesnek éreztem az adszorpció ellenőrzését a mintakezelési folyamat során, a minta előkészítéstől a HPLC injektálásig. Ellentétben azzal, hogy az elmúlt években használt automatikus HPLC-rendszerekkel manapság többnyire figyelmen kívül hagyják az adszorpció jelenségét, az ilyen keserű tapasztalatok ösztönözték az adszorpció megértését, és motiválták a mintaüvegek és a műszer adszorpciójának szabályozására irányuló munkám. A tapasztalatok alapján ma is arra törekeszem, hogy először megértsem a minta esetleges adszorpcióját a mintaüveghez és a műszerhez, és hogy a minta-előkészítést ennek megfelelően alakítsam.

Nemrég hallottam egy LC/MS analitikustól, hogy: "A plazmaminta-oldatokban a célkomponens-csúcsok észlelhetők, de a standard oldatban nem detektálhatóak", vagy "amikor az előző napon készített standard mintaoldatot megmérem, nem detektálok benne csúcsokat”. Míg ezeknek a problémáknak az oka a minta stabilitásán alapuló romlásnak tulajdonítható, az esetek többségében könnyen felismerhető a tartály adszorpciója. Különösen a plazmamintáknál tudjuk, hogy a mintában lévő szennyeződések elsősorban a tartályokban adszorbeálódnak, megakadályozva a célkomponensek adszorpcióját. Ez ugyanaz a gondolat, amely mögött a szarvasmarha-szérumalbumin (BSA) mint adszorpció-gátló szer alkalmazása áll. Mindenesetre, amíg az LC/MS által végzett analitikai értékelés továbbra is fontos szerepet játszik, és elvárásaink súlyát hordozza, arra kell törekednünk, hogy alaposan megértsük a minták tartályokhoz való adszorpciójának jelenségét, hogy rendkívül megbízható eredményeket kapjunk.

Ebben a kísérletsorozatban a mintaüveghez való adszorpciójának mechanizmusát a HPLC elválasztás mechanizmusa szempontjából értelmeztem. A HPLC során az elválasztás mechanizmusa nem több, mint egy mozgófázis használata az oldott anyag adszorpciójának erősségének szabályozására egy állófázisban. Ha ennek analógiáján ezt a mechanizmust a mintaüveghez való adszorpciójának jelenségére vetítjük, akkor az állófázis a tartály anyaga, míg a mozgófázis a mintaoldat, és az üvegre adszorbeált anyagok retenciós viselkedése az adszorpciós erősség.


A minta-előkészítéshez használt mintaüvegek általában két fő anyag egyikéből készülnek: üveg és műanyag tartályok (polipropilén: PP, polietilén: PE). Az üvegedények felületét erősen hidrofil szilanol és hidrofób sziloxán csoportok borítják (dehidratált szilanol, amely a szilikagél olvadása/képződése során keletkezik magas hőmérsékleten). Következésképpen vizes oldatban az üvegtartályok egyszerre váltják ki a molekulák ionos adszorpcióját szilanolcsoportokhoz (pozitív ioncserélő mód) és hidrofób adszorpciót a sziloxáncsoportok miatt (fordított fázis). Az ionos adszorpciónak ez a jelensége megfelel a HPLC-oszlopon a maradék szilanol által okozott csúcsok tailingesedésének és a bázikus vegyületek megnövekedett visszatartásának. Műanyag tartályok esetén az egyetlen adszorpció, amelyet a tartály anyaga (nagy molekulatömegű polimerek) okoz, a hidrofób adszorpció. Vagyis az adszorpció mechanizmusa a tartály anyagától függően eltérő. (Lásd: 1. ábra.) Ezen jellemzők miatt a magas pKa-értékkel (sav disszociációs állandóval) rendelkező bázikus vegyületek hajlamosak az üveghez (szilanolhoz), a nagy logP-vel (oktanol/víz megoszlási koefficiens) rendelkező vegyületek pedig az üveghez és a műanyaghoz is adszorbeálódni. A minta-előkészítés során az adszorpció kiküszöbölésére tett intézkedések egyike, hogy először a célkomponens/ek fizikai tulajdonságai (pKa és logP) alapján kell kiválasztani a tartályokat.

Visszatekintve ezekre a frusztráló tapasztalatokra, mivel az alacsony koncentrációjú mintáknál a vialhoz való adszorpció nyilvánvalóbb, az analitikai módszerek megbízhatósága szempontjából nagyon fontos az alacsony koncentrációjú minta-előkészítés olyan feltételeinek megtalálása, amelyek csökkentik a mintaüveghez és műszerekhez való adszorpciót. Az alábbiakban összefoglaltam a minta-előkészítési módszereket, amely alkalmazva csökken a tartályokhoz való adszorpció. Az első dolog annak megállapítása, hogy a célvegyület(ek) bázikusak, savasak vagy semlegesek. Ezt követően különböző minta-előkészítési módszereket kell alkalmazni attól függően, hogy a minta előkészítése üveg vagy műanyag mintatartó edényben történik.

       1) Savas és semleges vegyületek

A savas és a semleges vegyületek főként az üveg- és műanyag PP vialokon adszorbeálódnak hidrofób adszorpcióval. Ezért a mintaoldathoz szerves oldószert (metanol, acetonitril stb.) vagy nemionos felületaktív anyagot adnak az adszorpció csökkentése érdekében. Bár a célvegyület logP értékétől függ, 10-50% szerves oldószer vagy körülbelül 0,1% felületaktív anyag hozzáadása általában hatékonyan csökkenti az adszorpciót a minta-előkészítés során.

       2) Bázikus vegyületek

Óvatosan kell eljárni a minta-előkészítő edényanyagok kiválasztásánál, mivel a bázikus vegyületek különböző mechanizmusokkal adszorbeálódnak az üvegtartályokon és a műanyag PP-vialokon. Példaként a bázikus vegyületek adszorpciójának csökkentésére alkalmazott módszer vázlata látható a 2. ábrán.

2/1) Üveg vial

A bázikus komponensek ionos adszorpcióval és hidrofób adszorpcióval egyidejűleg adszorbeálódnak az üvegedényeken, ezért a minta-előkészítést úgy kell beállítani, hogy az adszorpció mindkét mechanizmusát ellensúlyozza. Sót (NaCl stb.) adnak hozzá, hogy pozitív sóionokat (Na+ stb.) adjanak az oldatba, amelyek csökkentik az ionadszorpciót azáltal, hogy blokkolják a szilanolcsoportokkal való kölcsönhatást. Alternatív megoldásként a szilanol disszociációja megelőzhető, ha a minta-előkészítést savas körülmények között (foszforsav, ecetsav stb. hozzáadásával) végezzük. A savas és semleges vegyületekhez hasonlóan a hidrofób adszorpciót is megakadályozzuk, ha a mintaoldathoz szerves oldószert vagy nemionos felületaktív anyagot adunk.

2/2) PP tartályok

A PP vialok hidrofób adszorpciót okoznak, ezért az adszorpció csökkentésére szerves oldószert vagy nem ionos felületaktív anyagot adnak a mintaoldathoz. Ezért az adszorpció csökkentésének hatékony eszköze mind az üveg-, mind a PP-vialokban az, ha a mintaoldatban só és szerves oldószer vagy nemionos felületaktív anyag egyaránt jelen van.

Ha HPLC-vel vagy LC/MS-sel nagy érzékenységű kvantitatív analízist végeznek, akkor figyelembe kell venni az adszorpció csökkentésére végzett minta-beállítások hatását az elválasztásra, valamint az ebből eredő hatást az MS analízis során fellépő ionelnyomásra. Továbbá egyre elterjedtebbek a kisebb átmérőjű töltetek és kisebb belső átmérőjű analitikai oszlopok, amelyek javítják a HPLC és LC/MS teljesítményt, és ezeket a változásokat is figyelembe kell venni, hogy a mintaoldatban (injektált oldatban) lévő szerves oldószer mennyisége hogyan befolyásolja az elválasztást. A rendkívül érzékeny kvantitatív analízishez sok vizsgálatra van szükség a mintaoldat optimális körülményeinek meghatározásához az edényekben való adszorpció csökkentésére. Olyan sokoldalú, alacsony adszorpciós fiolák kifejlesztésére fókuszáltam, amelyek alkalmasak HPLC autosamplerekben történő használatra, ahol a mintaedény felületi minősége az ionos és hidrofób minta adszorpciójának csökkentésére van optimalizálva.

LabTotal Vial

A LabTotal Vial olyan üveg vial, amely csökkenti a bázikus vegyületek adszorpcióját az üveg felületén. A 3. ábra a neutrális vegyület és a bázikus vegyület keverékének LabTotal Vialban és két, a kereskedelemben kapható hagyományos üvegvialban (A, B) történő tárolásának hatásainak vizsgálatából származó kromatogramokat mutat be.

Az egyes vial típusoknál tapasztalt százalékos csúcsterületek a polipropilén (PP) vialhoz képest (100%) zárójelben láthatóak. Az eredmények megerősítik, hogy a bázikus vegyület csúcsterülete csökken, ha kereskedelmi forgalomban kapható vialokat használnak. Az előző részben leírtak szerint a bázikus vegyületek hajlamosak adszorbeálódni az üvegfelületeken a szilanolcsoportokkal való kölcsönhatás révén. Ez az adszorpció csökkenthető a minta oldószerének beállításával, de az injekciós üveg felületén történő adszorpció csökkentésével a LabTotal Vial miatt nem szükséges a mintaoldószer összetételében történő változtatás mérlegelése. Az 1. táblázat a LabTotal Vial és a kereskedelemben kapható üvegfiolák összehasonlítását mutatja be négy különböző alapvegyület esetében. A 3. ábrához hasonlóan az eredmények megerősítik a LabTotal Vial hatékonyságát több bázikus vegyülettel.

A 4. ábrán (*az Országos Cerebrális és Szív- és érrendszeri Központ Gyógyszerészeti Osztályával végzett közös vizsgálat során kapott adatokon alapul) összehasonlításban látható a LabTotal Vial, a műanyag PP vial és egy hagyományos üveg vial az amiodarone komponensre, ami hidrofób és bázikus tulajdonsággal is bír.

A PP-fiola esetében a csúcsterületről azt feltételezik, hogy a hidrofób adszorpció miatt csökkent, az üvegfioláknál pedig a csúcsterületről azt feltételezik, hogy mind a hidrofób adszorpció, mind az ionos adszorpció miatt csökkent. Feltételezve, hogy a célkomponens állandó mennyisége adszorbeálódik az injekciós üvegben (az injekciós üvegeket homogén módon gyártják, az injekciós üvegek változása nélkül), az adszorpció problémája észrevehetőbbé válik alacsonyabb koncentrációknál, ami csökkenti a kalibrációs görbe linearitását. A LabTotal Vial tökéletes első választásnak, mivel csökkenti az adszorpciót, és ezt választva nem szükséges már az, hogy a célkomponensek fizikai jellemzői vagy azok koncentrációja alapján válasszon a különböző típusú vialok közül.

A LabTotal Vial formázási körülményeinek optimalizálása feltételezhetően egységessé teszi az üvegfelületet, és megnehezíti az adszorpciót. Az 5. ábrán láthatók a LabTotal vial és egy hagyományos vial felületének felvétele. A LabTotal Vial felülete simább, egységesebb, mint a hagyományos vial felülete.

Feltételezhetően a nagyobb adszorpció oka az átlagos vial nagyobb felülete. A későbbiekben a felület fizikai kialakítása és az adszorpció kapcsolatát vizsgálni kell az adszorpció további csökkentése miatt.

TORAST-H Bio Vial

A TORAST-H Bio Vial egy alacsony adszorpciós fiola, amelynek felületéhez kémiailag kötődnek hidrofil csoportok. A peptid fiolákba történő adszorpciójának fő mechanizmusait hidrofób adszorpciónak és ionos adszorpciónak tekintik. Ismeretes, hogy az üvegfiolákhoz való adszorpció főként az üvegfelületen lévő szilanolcsoportokhoz való ionos adszorpció révén történik, és a polimer fiolákhoz, például a PP-fiolákhoz való adszorpció főként a polimer felületén történő hidrofób adszorpció útján történik. A 6. ábra különböző típusú fiolák összehasonlítását mutatja, a mioglobin triptikus emésztését mintaként használva. Az eredmények megerősítik, hogy az üveg vial esetén az erősen poláros peptidek (körülbelül hét-nyolc perces retenciós időnél) egy része adszorbeálódott a felületen és ezért a kromatogramon kisebb csúcsot kapunk, míg a PP vial az erősen hidrofób peptidek adszorpcióját mutatta (12-17 perc közti csúcsok nagyon kicsik a PP vial esetén).

Az eredmények azt is megerősítik, hogy ezeknek a peptideknek az adszorpciója csökkent a TORAST-H Bio Vialban a hagyományos üveg és a PP vial-hoz képest.

A *1-gyel jelölt csúcsok esetében az eredmények megerősítik, hogy a TORAST-H Bio Vial használatával a visszanyerés körülbelül 40%-kal javult az üvegfiolához képest (csúcsterület-összehasonlítás). A *2-vel jelölt csúcsok esetében a csúcsok szinte kimutathatatlanok voltak a PP-fiola használatával, míg a csúcsok a TORAST-H Bio Vial használatával voltak kimutathatók. A fentiek tükrében magától értetődő, hogy az LC/MS módszerekkel végzett rendkívül érzékeny kvantitatív elemzések során a minta-előkészítés alatt a vial adszorpciója komoly probléma az analitikai módszerek megbízhatóságának biztosításában. Remélem ez a cikk sok analitikus számára hasznos lesz. A Shimadzu Group továbbra is vizsgálja a minta-előkészítés során az adszorpció csökkentését mintamérési eljárásokkal az analitikai módszerek megbízhatóságának biztosítása érdekében. Vizsgálati eredmények a közeljövőben várhatóak.

Csatolmány Méret
LabTotal Vial prospektus683.1 KB 683.1 KB
TORAST-H Bio Vial prospektus4.41 MB 4.41 MB

Ha tetszett, oszd meg:

Regisztráció

Miért érdemes regisztrálnia?

  • hozzáférhet védett tartalmakhoz, applikációkhoz
  • feliratkozhat szakmai hírleveleinkre, melyekben értesítjük az Ön szakterületét érintő friss hírekről
  • igénybe veheti online support szolgáltatásunkat

addRegisztrálok

Friss tartalom

Az 1. rész leírja a mintaüvegek adszorpciójának mechanizmusait, és azt, hogyan csökkenthető ez az adszorpció kereskedelmi forgalomba hozott, alacsony adszorpciós fiolák (LabTotal Vial és TORASTTM-H Bio Vial) használatával. Az utóbbi időben számos kérés érkezett alacsony adszorpciós polipropilén (PP) pipettahegy (PP tip) kifejlesztésére. Ezek a kérések olyan felhasználóktól érkeznek, akik szabványos PP hegyeket használnak mintavételre, hígításra és minta-előkészítésre, és azt tapasztalták, hogy az adszorpció rontja az analitikai eredmények megbízhatóságát.

Ennek megfelelően, a TORAST-H Bio Vial fejlesztését folytatva, a Shimadzu a PP hegyekhez való adszorpciót is vizsgálta, és megkezdte egy alacsony adszorpciós PP hegy kifejlesztését, és a világon először forgalomba hozta a TORAST-H pipettahegyet. Ebben a részben bemutatjuk a PP hegyek adszorpciójának jelenségét, áttekintést adunk a TORAST-H Tipről, és ismertetjük annak adszorpciót csökkentő hatását.

Összefoglalónkkal szeretnénk rávilágítani a komponensek vialban történő adszorpciójának problémájára, lehetséges megoldására.

Az automata mintaadagolóval injektált minta kapilláris csöveken keresztül jut el a(z) (U)HPLC oszlophoz. Ha a mintaoldószer és a mozgófázis nem megfelelően keveredik amíg a minta eléri az oszlopot, a csúcs alakja torzulhat. A csúcs kiszélesedik, ha a mozgófázisnál nagyobb elúciós erősségű mintaoldószert használunk. Ez hatványozottan jelentkezik a kisebb belső átmérőjű csöveket alkalmazó UHPLC-rendszerek esetén.

A folyadék-folyadék extrakció (LLE), támogatott folyadék extrakció (SLE), és szilárd fázisú extrakció (SPE) technikák már évtizedek óta léteznek, és ha szerves minta-előkészítést végez, akkor legalább az egyik technikában már járatos. De ismeri-e mindegyik technikát? Miben hasonlóak? Miben különbözőek? Tekintse át ezt velünk!

A Shimadzu LC/MS/MS foszfolipid MRM-könyvtár két módszert tartalmaz: egyet a foszfolipidek osztályozására a biológiai minták fő foszfolipideinek átfogó elemzéséhez, a másikat pedig a zsírsavösszetétel meghatározására, amelyet az osztályozási módszerrel kapott analitikai eredmények felhasználásával hoztak létre. A könyvtár a 14-22 szénatomszámú zsírsavakat tartalmazó foszfolipideket célozza meg, és több mint 867 komponenshez tartalmaz MRM-átmeneteket. A könyvtár lehetővé teszi a foszfolipid profilalkotás elvégzését egy foszfolipid osztályozási módszerrel végzett kezdeti elemzéssel. Ezt követi egy módszer létrehozása a zsírsavösszetétel meghatározására az első analízis során kimutatott foszfolipidcsúcs alapján, majd ezt használva egy második elemzés elvégzése során a zsírsavösszetétel meghatározása történik meg.

A bomlásból származó hisztamin és tiramin, a hisztidin és a tirozin degradációjából keletkezik mikroorganizmusok hatására. Ha a lefogyasztott élelmiszerek, előre feldolgozott termékek, vörös húsú halak mint tonhal, bonito, makréla stb., nagy mennyiségű hisztamint tartalmaznak, akkor ételmérgezési tünetek jelentkezhetnek úgy mint láz, kiütések, szívdobogás. Az erjesztett élelmiszerekhez -mint bor vagy sajt- szintén kapcsolódhat hasonló jelenség. Ezenkívül a tiramin is erősítheti a hisztamin toxicitását, és az élelmiszerrel összefüggő migrén okozójaként jelentették.

Bár Japánban nincsenek speciális hisztaminnal kapcsolatos előírások, más országokban, beleértve az Egyesült Államokat és az EU-t, a hal- és halászati termékekre vonatkozóan a Codex (Nemzetközi Élelmiszer Szabványok) szabályozási határértékeit állapították meg. Mivel a tiramin és a hisztamin -az aminosavakhoz hasonlóan- aminocsoportot tartalmaz, a fluoreszcencia detektálása lehetséges az orto-ftal-aldehiddel (OPA) való derivatizálással. Itt bemutatunk egy példát a tiramin és a hisztamin elemzésére a Prominence Amino Acid Analysis rendszer segítségével, amelyben a detektálást oszlop utáni fluoreszcens származékképzéssel végezzük. Az ehhez az alkalmazáshoz rendelkezésre álló mozgófázis és reagens készlet tartalmazza a szükséges mozgófázisokat és reagenseket, így kiküszöbölik a mozgófázis előkészítésétéből adódó bizonytalanságot. Ezen kívül, mivel a minta előkezelése csak szűrést és hígítást tartalmaz ennél az alkalmazásnál, így az elemzés bonyolult feldolgozás nélkül is elvégezhető.

2021. szeptember 1-től a Simkon Kft. látja el a Biotage teljes körű képviseletét Magyarországon.

A tandem tömegspektrométer és a Probe Electrospray Ionization (PESI) módszer kombinációja lehetővé teszi Everolimus és Abirateron komponensek kvantitatív vizsgálatát plazmából, közvetlenül a fehérjekicsapást követően.

A megfelelő rendszerindítási folyamat: a HPLC rendszer ekvilibrálása és a specifikus rendszeralkalmassági teszt (SST) futtatása kritikus lépések az LC futtatások előtt azért, hogy biztosítsuk a magas adatminőséget (reprodukálhatóság, pontosság, stb.) és hogy csökkentsük a karbantartás költségeit, növeljük az oszlop élettartamát. Ezek a lépések időigényesek a felhasználó számára, de ha nem megfelelően végzi ezeket el, az adatromláshoz és a szükséges újramérés miatti időveszteséghez vezetnek. Ebben az összefoglalóban azt mutatjuk be, hogy a Shimadzu hogyan tudja automatikusan felkészíteni a készüléket a mérésre.

A sejttenyésztési folyamatok optimalizálása és ellenőrzése elengedhetetlen a biofarmakonok termelési hatékonyságának növeléséhez. A sejtterápia területén -beleértve a regeneratív gyógyászati eljárásokat is- különösen fontossá vált a tenyésztési folyamatok fokozott ellenőrzése, csökkentve ezzel a sejtek variabilitását és javítva a sejtek tömegtermelésének konzisztenciáját. Ezen célokra hasznos információt ad a kutatóknak a sejttenyészet felülúszó összetevőinek monitorozása. Jelenleg a tenyésztési folyamat felügyeletét pH méréssel, oldódó gázok és néhány komponens, pl.: glükóz, glutamin, laktát és ammónia mennyiségének mérésével végzik.